Влияние минерального состава питательной среды на процесс регенерации груши в условиях in vitro

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Особенности введения экспланта в стерильную культуру


Происхождение экспланта. Это в первую очередь связано с местопо-ложением вычленяемой части на растении, а также с источником происхож-дения эксплантов (сеянцы в ювенильной фазе, взрослые деревья.
Многочисленными экспериментами установлено, что экспланты растений, находящихся в ювенильной фазе, имеют гораздо большую способ¬ность к массовому формированию побегов и их укореняемости у большинст¬ва плодовых культур, в том числе у яблони и груши по сравнению с эксплан- тами взрослых деревьев.
Большим регенерационным потенциалом обладают терминальные поч-ки, по сравнению с боковыми. Это явление можно объяснить специфическим содержанием эн¬догенных регуляторов роста (ауксиноподобных веществ) в терминальных почках.
Сроки изоляции. Большинство исследователей счи¬тают, что лучшим сроком введения в культуру in vitro является фаза выхода из покоя и активный рост. Качество подвоев яблони и вишни, полученных методом in vitro, зависит от сроков их изоляции
Проявление регенерационной способности экспланта обусловлено его физиологическим состоянием и во многом зависит от фазы развития исход-ного маточного растения.
В то же время, для вишни и некоторых подвоев яблони успешное вве-дение эксплантов в культуру с последующей пролиферацией побегов было осуществлено, когда в качестве исходного материала использовали растения, находящиеся в состоянии покоя [8].
Размер эксплантов. При введении в культуру важное значение имеет размер эксплантов. Более крупные экспланты легче регенерируют. Однако высокая их инфицированность бактериальной и другой микрофлорой приво-дит к значительным выпадам. С увеличением размера экспланта в пределах от 0,1 до 10 мм от апикальной меристемы до почки, включающей примордиальную зону и часть наружных листьев) инфицированность при обычных ме¬тодах стерилизации увеличивается и достигает 80-90% Свободными от инфекции оказались экспланты размером 0,1 мм (собственно меристема), регенерация же их затруднена и для нее не¬обходимо более продолжительное время.
Считается также, что чем меньше размер изолируемого экспланта, тем больше вероятность оздоровления. По данным у систематически заражаемых растений концентрация вируса в побегах уменьшается к периоду вегетации. Это дает возможность посредством экс¬плантации (отсечения) меристематической ткани размножать в стерильной культуре in vitro свободные от вирусов и патогенов растения. Так как внутри точки роста побега собственно меристема образует только небольшое коли¬чество слоев клеток размером менее ОД мм, то в зависимости от технических возможностей отсекаются кусочки ткани длиной от 0,2 до 0,4 мм, которые состоят из меристемы и смежных слоев ткани с 1-2 листовыми зачатками. Таким образом, минимальная концентрация или полное отсутствие вирусных частиц характерны для точек роста. Причина этого явления до конца не ясна. Можно предположить, что пониженная концентрация вирусных частиц в. ак¬тивно делящихся меристематических клетках связана с отсутствием в по-следней развитой проводящей системы. Кроме того, это можно объяснить и физиологическими особенностями клетки, в частности, специфическим ба-лансом биологически активных веществ (например, ауксинов), а также про-ницаемостью стенок меристематических клеток. Нельзя также исключать возможное ингибирующее влияние на репликацию вирусных частиц отдель-ных компонентов питательной среды - ауксинов, цитокининов и др [9].
Элиминация вирусных болезней методом культуры меристем является по-прежнему одним из главных направлений применения метода клонально- го микроразмножения. Одной из основных причин, позволяющих оздоровить растения от вирусных инфекций, также объясняют наличием в тканях градиента концентрации вирусных частиц.
Однако при использовании апикальных верхушек размером 0,1-0,2 мм без листовых примордиев приживаемость их бывает очень низкая и состав-ляет 1-10% Поэтому, если не ставится задача оз¬доровления, для массового размножения предпочтительно использовать экс- планты размером 0,5-2,0 мм, состоящие из конуса нарастания и двух-трех листовых примордиев и подстилающего слоя ткани Такие экспланты до¬вольно легко регенерируют и сравнительно слабо инфицированы. Использо¬вание эксплантов большего размера быстрее приводит к успеху микрораз¬множения, что, прежде всего, объясняется сокращением лаг-периода при введении в культуру и обусловлено влиянием окружающей ткани
Стерилизация. Часто для стерилизации растительных тканей яблони и груши используют двухступенчатую стерилизацию, когда растительные вер-хушки длиной 2-3 см стерилизуют сначала в течение 2 секунд в 70%-ном этиловом спирте, а потом в течение 15 мин в 0,2%-ной сулеме
Применение смеси 3 % перекиси водорода с 96 % этанолом и после-дующая обработка 0,01 % раствором сулемы обеспечивают практически пол¬ное освобождение эксплантов груши от инфекции
Исследования O.A. Леонтьева-Орлова показали, что изучение стерилизующих препаратов - диацида, мертиолата и сулемы, при разных экс¬позициях показало их неодинаковое влияние на контаминацию и состояние эксплантов яблони. Стерилизация диацидом в течение 5-10 мин обеспечивала освобождение от инфекции. Стерилизация мертиолатом не давала такого эф¬фекта, к тому же препарат действует на апикальные верхушки яблони более жестко, чем диацид, вызывая повреждение отдельных тканей, а затем и нек¬роз самого экспланта. Для полного освобождения от инфекции целесообраз¬но стерилизовать экспланты диацидом не более 10 мин с предварительной промывкой водой не более 2 часов [12].
Кроме ртутьсодержащих препаратов используют также препараты, со-держащие хлор - гипохлорит натрия или кальция. В частности, сначала верхушки побегов подвоя яблони M 26 промывал в течение 1 часа в проточной воде, за¬тем-на 40 мин помещал в 10%-ный раствор препарата доместос (гипохлорит натрия) и после этого 5 раз ополаскивал в стерильной воде предложили стерилизовать побеги подвоя яблони Оттава-3 сначала BV 95%-ном спирте - 5-10 секунд, а затем 10%-ном Jivex -5 мин и 0,6% - ном. растворе NaOCl [19].
В отдельных случаях полезно проводить тест на зараженность эксплан-тов сапрофитной микрофлорой, при котором экспланты сначала помещают на среды без дорогостоящих добавок, а через 7-10 дней после выбраковки «чистые» экспланты пересаживают на среды с полным минеральным соста-вом для дальнейшего культивирования.
Исследователи рекомендуют использовать препараты, обладающие бактериостатическим действием, состав которых не расшифровывается. Очень часто для этих целей рекомендуют флороглюцин. По мнению В.А Вы-соцкого включение таких реагентов в питательную среду необосно¬ванно, а иногда вредно, т.к. способствует размножению экземпляров; пора¬женных патогенными микроорганизмами.
Максимальная эффективность при стерилизации, в частности побегов груши, может быть достигнута- при использовании белково-связывающего стерилизатора - нитрата серебра в концентрации 0,1-0,3%.
Выбор стерилизующего реагента зависит от источника изоляции экс- планта. Исследования, проведенные Н.И. Туровской с эксплантами, взятыми в фазу активного роста (май, июнь) и развившихся из почек одре¬весневших побегов после хранения их при пониженных температурах в тече¬ние зимы, показали их значительные различия в степени инфицированности. Так, было установлено, что гибель эксплантов-почек от сапрофитной микро¬флоры после стерилизации их 0,1 % раствором диацида в течение 8 мин была в 3-4 раза больше, чем меристематических верхушек [1].
Солевой состав. Эффективность клонального микроразмножения в значительной степени определяется правильным подбором оптимального со-става среды, особенно на этапах введения в культуру и собственно микро-размножения.
Наибольшее распространение получила среда Мурасиге-Скуга для тканей табака. Эта среда содер¬жит хорошо сбалансированный состав минеральных веществ, благоприятный для роста изолированных тканей многих растений.
Большинство исследователей считают, что среда Мурасиге-Скуга является наиболее приемлемой для культивирования эксплантов яблони и груши на основных этапах микроразмножения.
Н.И. Туровская при введении в культуру in vitro подвоев яблони 54-118 и 62-396, кроме среды Мурасиге-Скуга, испытывала и другие среды — Гамборга и Нича-Нича. Было установлено, что к концу второго месяца куль¬тивирования преимущество в развитии принадлежит эксплантам, культиви¬руемым на среде Гамборга, где количество их, достигших фазы розетки в 4,5¬5 раз больше по сравнению со средой Мурасиге-Скуга. После трех субкуль¬тивирований (через 3 месяца) экспланты на среде Уайта погибли все, на сре¬де Hura-Hura отставали в развитии.
Также в исследованиях с плодовыми культурами Н.И. Туровской кроме сред Мурасиге-Скуга и Гамборга, на этапе собственно микро-размножения была использована среда Ллойда-Маккауна установлено преимущество последней. В другом опыте с подвоями яблони 62-396 и 54-118 лучшей сре¬дой оказалась среда Гамборга. Через 6 недель культивирования на ней все побеги подвоя 62-396 достигли оптимальных для клонирования размеров у подвоя 54-118 - 83%. На контрольной среде Мурасиге-Скуга у обоих подвоев образовалось по 67% таких побегов.
Проведенный анализ литературных данных позволяет сделать вывод о том, что нет единого мнения в использовании той или иной среды. По всей вероятности такой разброс полученных данных связан с генотипической ре-акцией сортов груши в условиях in vitro [5].
Биологически активные вещества. Существенную роль в регуляции морфогенеза при клональном микроразмножении играют регуляторы роста. Это обширная группа природных и синтетических соединений, которые в малых дозах активно влияют на обмен веществ высших растений, что приво-дит к значительным изменениям в их росте и развитии.
Закономерности действия регуля¬торов роста обусловлены различием их химической природы и функцио¬нальной ролью вещества. Эффективность воздействия их зависит от концен¬трации и направленности действия. При низких концентрациях происходит стимуляция ростовых процессов, при средних - торможение, а при высоких полная их задержка.
Из природных регуляторов роста наиболее известны фитогормоны (ци- токинины, гиббереллины, абсцизовая кислота, этилен). Являясь продуктами жизнедеятельности самих растений, фитогормоны участвуют в регуляции процессов метаболизма, в значительной мере определяя характер и темпы формообразовательных процессов [2].
Наиболее часто при введении в культуру in vitro и на этапе собственно микроразмножения используют цитокинины: природный - зеатин, синтети-ческие - 6-бензиламинопурин (БАП), 6-фурфураминопурин (кинетин), 2- изопентениладенин и его синтетические аналоги — индолил -3-масляную кислоту (ИМК), 1-нафтилуксусную кислоту (НУК); гиббереллины (ГК); витамины: аскорбиновую кислоту, пиридоксин HCl, никотиновую кислоту, тиамин HCl, и другие [3].
По мнению одних авторов, считают оптимальным набором для регенерации меристематических верхушек яблони и груши введение в среду ИМК, БАП, ГК в концентрации от 0,1 до 0,5 мг/л. Разработанная для плодовых культур сре¬да включала не только БАП, ИМК, ГК, но и флороглюцин. Установили, что флороглюцин может оказывать стимули-рующее последействие на ризогенез яблони, а также усиливать пролифера-цию у подвоев яблони M 7 и M 26.
Однако позже экспериментально было доказано, что введение в среду флороглюцина, ИМК и ГК не обязательно. В исследованиях X.S. Shen, при микроразмноже¬нии груши сортов Вильяме, Триумф, Пакхема и Бере Боск также было уста¬новлено, что введение дополнительных добавок в среду (ИМК, НУК, ГК) способствует образованию 1-2 дополнительных побегов на апикальных эксплантах, при увеличении концентрации ИМК до 15. Также определено, что для каждого сорта оптимальная концентрация ИМК индиви-дуальна.
На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, что нет единого мнения о влиянии регуляторов роста на первых двух этапах микро-размножения.
Ученые подчеркивали, что коэффициент размножения яблони зависит, в основном, от соотношения ауксинов и цитокининов в пита¬тельной среде. Были определены их концентрации. Для подвоя яблони М'4 установлено, что на среде содержащей 1,15 мг/л БАП и 0,15- 0,20 мг/л ИМК, образуется максимальное количество хоро¬шо развитых побегов. Неделчева и др. считают, что при микроразмножении груши оптимальное содержание БАП 1,0 мг/л и ИУК 0,01 мг/л. М. рекомендует на этапе введения в культуру при микрораз¬множении яблони наряду с 2,0 мг/л БАП использовать НУК в концентрации 0,4 мг/л. По данным Ю.Г. изучение содержания БАП, кинетина, ИМК, ИУК, НУК, ГК в концентрациях от 0,1 до 10,0 мг/л в раз-личных комбинациях на меристематических верхушках вишни показало, что наибольшим морфогенетическим потенциалом обладает БАП. При высокой гормональной насыщенности питательной среды происходит угнетение про-цесса морфогенеза вплоть до гибели растительной ткани.
По мнению О.А. Леонтьева-Орлова, введение в среду только БАП на этапе введения в культуру in vitro положительно влияло как на рост побегов яблони, так и ризогенез. Совместное введение ГК и ИМК в концентрациях 0,1 и 10,0 мг/л в присутствии БАЛ привело к ингибированию ризогенеза на среде с 1,0 мг/л ИМК, независимо от концентрации ГК, отме¬чено зарастание меристематических верхушек каллусом. Переход экспланта к каллусогенезу может быть объяснен нарушением эндогенного химического баланса под влиянием факторов питательной среды. Зарастание каллусом апекса может быть вызвано нарушением процесса образования проводящей системы, в результате меристема оказывается изолированной от корней. Клетки этой ткани, лишенные продуктов питания, теряют свои меристематические свойства и начинают неорганизованно делиться. Процесс охватывает весь эксплант и завершается его гибелью. Кроме того, раневая поверхность экспланта яблони и прилегающие к ней клетки, видимо, обладают высокой чувствительностью к регуляторам роста.
Необходимость использования только БАП при культивировании яб-лони и груши на первых двух этапах микроразмножения подтверждается большинством. На этапе введения в культуру in vitro ими была установ¬лена оптимальная концентрация БАП (0,5 до 1,5мг/л). А на этапе собственно микроразмножения рекомендуется увеличить содержание БАП до 1,5- 3,0 мг/ Использование более высоких кон¬центраций БАП (с выше 3,0 мг/л) на этапе пролиферации приводит к форми¬рованию эксплантов с очень короткими побегами красноватого цвета, кото¬рые не пригодны для укоренения [2,7].
Другие авторы рекомендуют вместо цитокининов пуринового ряда ис-пользовать цитокинины ряда дифенилмочевины, в частности- тидиазурон (М-фенил-N-1,2,З-тидиазолил-5-мочевину), который обладает большей ак-тивностью. Механизм действия тидиазурона пока не изучен.
Высокие кон¬центрации тидиазурона уменьшали высоту побегов и изменяли морфологию листьев. Присутствие тидиазурона на этапе пролиферации побегов усиливало ризогенез на этапе укоренения.
Использование различных цитокининов (кинетина, БАП, зеатина) на этапе собственно микроразмножения у сортов яблони Еллоуспур, Старкспур Голден и Голден Делишес показало, что наиболее быстрое размножение обеспечивал БАП, зеатин ускорял рост побегов.
Введение в среду для размножения 2-изопентиладенина не стимулиро-вало процесс пролиферации у Vitus vinifera L [10].
И.М. Фартизинова предложила в качестве стимулятора роста при микроразмножении груши использовать настойку лимонника (15-20 ка-пель/л). Предложенный прием обеспечивал сокращение сроков получения полноценных регенерантов, увеличение коэффициента размножения, сниже-ние себестоимости питательной среды [2].
Известно, что при изоляции эксплантов, особенно у плодовых культур, в результате травмы активизируются ферменты, окисляющие фенолы расте-ний, в особенности полифенолоксидаза. В результате интенсивной деятель-ности этого фермента в тканях плодовых культур накапливаются полифенолы в виде гидролизованного или конденсированного танина и продукты дальнейшего окисления полифенолов – хиноны. При этом продукты окисления фенолов не только вызывают потемнение ткани и питательной среды, но и могут подавлять деление и рост эксплантов). Это послужило основании.
Существует предположение, что тидиазурон способствует превращению ци- токининовых рибонуклеидов в биологически более активные рибонуклеоти- ды установили, что тидиазурон в концентрациях 0,1 и 1,0 оказывал на микроразмножение побегов яблони такой же эффект, как в концентрации 4,4 мл. Высокие кон¬центрации тидиазурона уменьшали высоту побегов и изменяли морфологию листьев. Присутствие тидиазурона на этапе пролиферации побегов усиливало ризогенез на этапе укоренения.
Использование различных цитокининов (кинетина, БАП, зеатина) на этапе собственно микроразмножения у сортов яблони Еллоуспур, Старкспур Голден и Голден Делишес показало, что наиболее быстрое размножение обеспечивал БАП, зеатин ускорял рост побегов: Из изучаемых сортов наибо-лее чувствительны к действию цитокининов был сорт Старкспур Голден.
Введение в среду для размножения 2-изопентиладенина не стимулиро-вало процесс пролиферации у Vitus vinifera L.
И.М. Фартизинова предложила в качестве стимулятора роста, при микроразмножении груши использовать настойку лимонника (15-20 ка-пель/л). Предложенный прием обеспечивал сокращение сроков получения полноценных регенерантов, увеличение коэффициента размножения, сниже-ние себестоимости питательной среды.
Известно, что при изоляции эксплантов, особенно у плодовых культур, в результате травмы активизируются ферменты, окисляющие фенолы расте-ний, в особенности полифенолоксидаза. В результате интенсивной деятель-ности этого фермента в тканях плодовых культур накапливаются полифено-лы в виде гидролизованного или конденсированного танина и продукты дальнейшего окисления полифенолов - хиноны При» этом продукты окисления фенолов не только вызывают потемнение ткани и питательной среды, но и могут подавлять деление и рост эксплантов Это послужило основани¬ем к изучению возможных способов, препятствующих выделению фенолов и продуктов их окисления в питательную среду.
Предложенная еженедельная смена питательной среды предупреждает почернение и гибель эксплантов. Однако этот прием трудоемок и требует дополнительных затрат. Согласно выдерживание эксплантов в течение нескольких часов в воде способствует выживанию верхушек побегов при посадке на питательные среды. Исследование Н.В. Катаевой не подтвердили значимость такой обработки.
Для снижения окислительной активности ферментов на этапе введения- эксплантов в культуру in vitro ряд исследователей рекомендует использова-ние антиоксидантов. По методике, разработанной для культуры ткани яблони сорта Макинтош, предлагается введение в среду по- ливинилпирролидона (ПВП) в концентрации 5-10 г/л. O.A. Леонтьев-Орлов также считает, что для снятия отрицательного действия фенольных соединений у яблони необходимо использовать ПВП в концентрации 50 г/л, хотя ПВП отрицательно влияет на прирост побегов [8,11].
В.М. Бурдасов и др. отмечают, что окисление эксплантов яблони снижалось при культивировании их в течение первых 3-5 дней при темпера-туре 3-5° С. Поливинилпирролидон (50 г/л) и 2-3 кратные пересадки эксплан¬тов на свежие среды также уменьшали их гибель на 30-50%.
Согласно Р.Г. Бутенко существенно улучшить ситуацию можно отмывкой экспланта в течение 4-24 часов дистиллированной водой или сла-бым раствором аскорбиновой кислоты в концентрации 1 мг/л. Другие авторы рекомендуют экспланты после стери¬лизации промывать в растворе аскорбиновой кислоты (1мг/л), либо вводить в питательную среду антиоксиданты: глютатион - восстановленную форму — 4-5 мг/л, дитиотриэтол - 1-3 мг/л, диэтилдитиокарбомат - 2-5 мг/л, поливи-нилпирролидон (ПВП) - 5000-10000 мг/л. Исследования Г.П. Атрощенко свидетельствуют о том, что включение антиоксидантной смеси (ас¬корбиновая кислота + ДИЕКА + ЭДТА) в питательную среду существенно повысило выход эксплантов клоновых подвоев яблони на этапе введения в культуру in vitro. При этом процент прижившихся меристематических вер¬хушек подвоев 62-396, 3-5-44, 3-3-72 оказался в 1,5 раза выше, чем при обра¬ботке эксплантов антиоксидантами и в 2,5 раза выше при использовании пи-тательной среды без этих веществ [16,17].
1.2 Роль солевого состава среды и регуляторов роста на органогенез плодовых культур

Солевой состав. Существенное влияние на индукцию адвентивного- органогенеза оказывает солевой состав среды. При изучении солевого соста-ва питательной среды многие авторы уделяли внимание концентрации мак-росолей. По мнению Туровой измене¬ние содержания NO3 и NH4+ в среде до соотношения 1:4 и 1:8 по сравнению с 2:1 при культивировании листовых эксплантов подвоя яблони M 26 показа¬ло, что при соотношении 1:4 наблюдалась максимальная регенерация (100%). Уменьшение содержания макросолей в 1/2 и 1/4 раза способствовало адвен¬тивному органогенезу груши. Однако эти среды оказались не пригодны для регенерации эксплантов других форм яблони
По данным В.М. Тюленева, для эффективной регенерации ад¬вентивных побегов у яблони и груши оптимальное соотношение ионов NO3 : NH}+ - 2:1. Увеличение соотношений ионов NO3 : NH/ до 3:1, 4:1, 5:1 и 6:1 приводит к уменьшению индукции адвентивных побегов.
Многие использовали для регенерации плодовых культур среду №6.
Сравнительное изучение сред №6 и LS, проведенное показало, что среда №6 превосходит среду
LS по регенерации адвентивных побегов. Среда №6 отличалась от среды LS более низким содержанием солей N, К, Р, Са и Mg [20].
Исследования И.В. Бартиша и В.И. Корхового также свидетель¬ствуют о том, что уменьшение содержания макросолей в среде Мурасиге-Скуга при культивировании клона яблони RF1 и сорта яблони Айда- ред способствует регенерации побегов из листовых эксплантов с высокой частотой. Среда №6 также была эффективна, как и среда Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией солей. Однако в опытах Высоцкого культивирование 14 генотипов яблони на средах Мурасиге-Скуга и №6 пока¬зало, что полная среда Мурасиге-Скуга оказалась лучшей для индукции по¬бегов без образования каллуса, чем среда №6 [14].....