Глубинного культивирования

Содержание
Аннотация
Нормативные ссылки
Определение
Обозначения и сокращения
Введение
1 Аналитический обзор
1.1 Общая характеристика, физико-химические свойства ферментов
1.2 Получение и применение гидролитических ферментов
1.3 Способы культивирования продуцентов ферментов
2 Экспериментальная часть
2.1 Постановка задачи эксперимента
2.2 Методики эксперимента
2.3 Результаты и обсуждение
2.4 Выводы
2.5 Предложения по разработке технологической схемы
3 Безопасность жизнедеятельности
Заключение
Список литературы
Введение
В своем послании Президент РК Н.Назарбаев поставил основной задачей “КазАгро”- системно решать вопросы повышения уровня производительности сельского хозяйства, предотвращение деградации земель, укрепление эффективности использования водных и других природных ресурсов страны, развития биотехнологии. Бурное развитие комплекса наук биологического профиля с расширением практической сферы их применения обусловлено также социально-экономическими потребностями общества.
Целью данной работы является поиск оптимальной среды для глубинного культивирования P. ostreatus, определение протеолитической, целлобиогидролазной и амилазной активности экстрацеллюларных ферментов и способности ферментного комплекса P. ostreatus разрушать клеточные стенки дрожжей Sacharomyces cerevisiae.
Перспективность и эффективность применения биотехнологических процессов в различных сферах человеческой деятельности, от получения пищи и напитков до воспроизводства экологически чистых энергоносителей и новых материалов обусловлена их компактностью и одновременно крупномасштабностью, высоким уровнем механизации и производительности труда. Эти процессы поддаются контролю, регулированию и автоматизации. Биотехнологические процессы, в отличие от химических, реализуются в «мягких» условиях, при нормальном давлении, активной реакции и невысоких температурах среды; они в меньшей степени загрязняют окружающую среду отходами и побочными продуктами, мало зависят от климатических и погодных условий, не требуют больших земельных площадей, не нуждаются в применении пестицидов, гербицидов и других, чужеродных для окружающей среды агентов. Поэтому биотехнология в целом и ее отдельные разделы находится в ряду наиболее приоритетных направлений научно-технического прогресса и является ярким примером «высоких технологий», с которыми связывают перспективы развития многих производств.
Одним из основных биотехнологических производств чвляется производство ферментов. Ферменты - органические вещества белковой природы, которые синтезируются в клетках и во много раз ускоряют протекающие в них реакции, не подвергаясь при этом химическим превращениям. Вещества, оказывающие подобное действие, существуют и в неживой природе и называются катализаторами.
Ферменты, участвующие в фундаментальных процессах превращения энергии, таких, как расщепление сахаров, образование и гидролиз высокоэнергетического соединения аденозинтрифосфата (АТФ), присутствуют в клетках всех типов – животных, растительных, бактериальных. Однако есть ферменты, которые образуются только в тканях определенных организмов.
В последнее время необычно возрос интерес к микроорганизмам, обитающим в экстремальных условиях. В этом плане существенный интерес представляют засоленные почвы и обитающие в них бактерии. Доминантами в гетеротрофном бактериальном сообществе засоленных почв, в частности солончаков, являются в основном галофильные эубактерии p. Bacillus и экстремально галофильные архебактерии рода Halobacterium. Ферменты данных микроорганизмов представляют весьма специфическую группу белков, функционирующих в экстремальных физиологических условиях. Их изучение интересно не только с чисто научных позиций, но так же перспективно с точки зрения использования этих ферментов, работающих при низкой активности воды, в биотехнологии. Однако их изучение осложняется высокими концентрациями солей в среде, которые мешают не только выделению и очистке ферментов, но и изучению их физико-химических свойств.
В задачу данной работы входило исследование экскреторной активности гидролитических ферментов P. ostreatus в глубинной культуре.
1 Аналитический обзор
1.1 Общая характеристика, физико-химические свойства ферментов.
Вещества белковой природы, способные каталитически ускорять химические реакции, называют ферментами. Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов колоссальна. В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Биологические катализаторы по ряду признаков резко отличаются от неорганических катализаторов[1]. Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов. Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрат. Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. Ферменты могут обладать абсолютной, относительной, стереохимической специфичностью. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было изучено А.Я.Данилевским. Ингибиторы тормозят действие ферментов. Механизм ингибирующего действия сводится к двум типам торможения (необратимое и обратимое). Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным. Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способности осуществлять каталитическую функцию, на чем основано их применение в различных областях промышленности. В хлебопекарной промышленности применяют ферментные препараты, относящиеся к роду Aspergillus. В пивоваренной и спиртовой промышленности применяют амилазы ферменты, ускоряющие реакцию осахаривания крахмала. В кожевенном и меховом производстве применяют препараты протеиназ. Ферменты находят большое применение в медицине. Пепсин, трипсин, химотрипсин, липазу и амилазу применяют для лечения заболеваний ЖКТ. Протеолитические ферменты плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу для растворения тромбов в кровеносных сосудах. Кроме того, специфическую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика (заболевание может быть тестировано по уровню содержания фермента или соотношения его множественных форм в крови или реже в моче).
Физико-химические свойства ферментов.
Ферменты микробного происхождения составляют около половины производства препаратов на мировом рынке. Их эффективность и мощность намного превосходят синтетические катализаторы. Они высокоспецифичны по отношению к своим субстратам и ускоряют строго определённые химические реакции без образования побочных продуктов; ферменты функционируют в разбавленных водных растворах при физиологических значениях рН и температуры[2]. Ферменты функциональные единицы клеточного метаболизма. Действуя в строго определённой последовательности, они катализируют сотни многостадийных реакций, в ходе которых расщепляются молекулы питательных веществ, запасается и преобразуется химическая энергия, и из простых молекул-предшественников строятся макромолекулы, входящие в состав клетки. Ферментативный катализ происходит на расстоянии длины химической связи, поэтому акт катализа совершается на определённом участке поверхности макромолекулы, называемом активным центром. Современный уровень экспериментальных исследований позволил доказать, что он представляет собой набор небольшого числа функциональных групп, расположенных близко друг от друга и имеет вид впадин, выемок на поверхности молекулы фермента. Функциональные группы активного центра могут принадлежать звеньям полипептидной цепи, весьма удалённым друг от друга. Сближение их связано с формированием третичной структуры молекулы фермента. Вполне логично, что активный центр не имеет автономного существования. Нельзя провести какую-либо грань между активным центром фермента и остальной частью белковой молекулы. Именно это и является одной из причин высокой чувствительности и лабильности активного центра к различным воздействиям. К наиболее важным характеристикам ферментных препаратов, которые определяют возможность их применения на практике, относят рН, температурный оптимум, субстратную специфичность. Кривые строятся на основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН. В 1964 году была получена в высокоочищенном состоянии нейтральная протеиназа Bacillus subtilis. Фермент имеет довольно широкий оптимум рН 6,5 8,0. В щелочной области рН её активность снижается, достигая при рН 9,0 30% максимальной величины. Таким образом, ферменты активны только в определённом интервале рН. В большинстве случаев для каждого фермента имеется определённый оптимум рН. Это объясняется несколькими причинами:- истинное, обратимое влияние рН на скорость реакции (когда фермент насыщен субстратом); влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны от оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства);- влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по одну или обе стороны от оптимума. Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом. Например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к субстрату, а по другую результатом инактивации фермента. Итак, для всех известных ферментов зависимость скорости реакции от рН графически выражается в виде «колоколообразной» функции. Такие кривые строятся на основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН[3]. Форма кривых, описывающих зависимость скорости ферментативной реакции от рН, отражает способность важных для данного фермента протон - донорных связей или протон акцепторных групп в его каталитическом центре переходить при определённых значениях рН в состояние требуемой степени ионизации. Методы анализа температурных зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций основываются на классических принципах термодинамики и кинетики. Ферментативные реакции характеризуются также наличием «колоколообразной» зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком температурном интервале, что приводит к температурному оптимуму реакции. Эта способность влияния температуры на кинетику ферментативных реакций объясняется наложением двух эффектов (возрастание скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах). Многообразие форм, в которых проявляется влияние температуры на скорость ферментативных реакций, даёт основание ожидать, что анализ этого явления должен представлять большие трудности[4]. В действительности, однако, влияние температуры легко установить экспериментально. Влияние этого фактора на стабильность фермента можно изучить, инкубируя фермент при различных значениях температуры в течение определённого периода времени, а за тем определяя его активность в той температурной зоне, в которой он остаётся стабильным. Хорошо изученными являются протеиназа из Bacillus amyloliguefarias и протеиназа из Bacillus thermoproteolyticus (термолизин). Они довольно близки по своим свойствам. Однако термостабильность их значительно различается, так термолизин теряет 50% максимальной активности при температуре 84оС, за 15 минут при рН 7,2 , в то время как протеиназа Bacillus amyloliguefarias теряет за то же время 50% активности при температуре 59оС[5]. Ферментативная реакция в целом состоит, по крайней мере, из трёх последовательных стадий: образование фермент-субстратного комплекса, превращение этого комплекса в комплекс фермент-продукт и диссоциация промежуточного продукта. Влияние температуры на реакцию в целом является результатом её влияния на каждую из этих стадий. Известно много ферментов, для которых естественные условия их действия не совпадают с оптимальными параметрами рН и температуры. Таким образом, внешние факторы позволяют с достаточным эффектом регулировать интересующие процессы, особенно при технологической обработке биологических объектов, например мяса и мясных продуктов. Специфичность ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. По-видимому, только тогда, когда совпадение это достаточно полно, может образоваться фермент-субстратный комплекс и, следовательно, начаться процесс ферментативного катализа. Детальное изучение специфичности ферментов показало, что пределы её у разных ферментов различны. Одни ферменты обладают абсолютной специфичностью, т.е. каталитически ускоряют одну единственную реакцию. Примером такого фермента может служить уреаза[6]. Другие ферменты осуществляют катализ реакций определённого типа независимо от того, какие конкретные вещества в них взаимодействуют или распадаются. Основным признаком для ферментов этого типа является характер связи. Такие ферменты характеризуются, следовательно, групповой специфичностью. Наконец, некоторые ферменты отличаются стереохимической специфичностью, т.е. действуют только на один из пространственных изомеров. Примером могут служить ферменты, расщепляющие - и - метилглюкозиды. Катализируемая химическая реакция представляет тот специфический признак, по которому один фермент отличается от другого. Современная классификация основана на этом признаке. Ферменты делят на группы в зависимости от типа катализируемой реакции и на подгруппы, более точно характеризующие эту реакцию. Часто на практике протеолитические ферменты, известные и тем более мало изученные, подразделяются на группы в зависимости от оптимального значения рН действия на субстраты. Как правило, выделяют три группы:1. Щелочные протеиназы, стабильные и активно действующие в области рН 5- 10. Максимальная их активность обнаруживается при рН 9,5 - 10,5. Установлено, что это главным образом сериновые протеиназы (для акта катализа важную роль играют функциональные группы серина); они активно ингибируются диизопропилфторфосфатом (ДФФ)[7]. Нейтральные протеиназы с оптимумом рН для протеолиза около 7,0. В эту группу объединяют большинство металлоферментов, чувствительных к таким аддентам, как ЭДТА и о-фенантролин. Они не ингибируются ДФФ и тиоловыми реагентами, устойчивы при рН 6 9.3. Кислые протеиназы, активные при рН 2 5, не чувствительные к сульфгидрильным реагентам, металлохелатным агентам, тяжёлым металлам и к ДФФ. Для акта катализа этой группы ферментов важны остатки карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот. Вместе с тем отметим, что зависимость активность рН носит подчинительный характер и связана со структурой активного центра, определяющего механизм действия.
1.2 Получение и применение гидролитических ферментов
Гидролитические ферменты находят применение в различных областях биотехнологии, в частности, для удаления клеточных стенок растений и микроорганизмов, гидролиза белков, целлюлозы и других макромолекул, а также в научных исследованиях[8].
Получение ферментов из животных и растительных клеток предполагает разрушение последних, что требует выполнения достаточно сложных и длительных процедур очистки и стабилизации. Экономически обоснованным является получение грибных гидролитических ферментов. Это связано с тем, что мицелиальные грибы экскретируют ферменты в среду, где и осуществляется гидролиз субстратов.
При подборе продуцента гидролитических ферментов исходят из интенсивности его роста в культуре, экскреторной активности и спектра экскретируемых ферментов. Наилучшими продуцентами гидролитических ферментов, которые удовлетворяют этим требованиям, являются микроскопические грибы рода Trichoderma, Aspergillus и Penicillium. Однако среди экскретируемых этими грибами веществ обнаружены и микотоксины, поэтому ферментные комплексы этих продуцентов без предварительной очистки не могут использоваться, например, в пищевых технологиях[9].
В качестве продуцентов гидролитических ферментов изучали также базидиальные грибы рода Pleurotus, в частности P. оstreatus. Показано, что грибы P.оstreatus экскретируют протеазы, оксидазы, лакказы, пероксидазы, ксиланазы, фитазы и липазы. Из субстрата культивирования P.оstreatus были выделены также гидролитические ферменты амилаза, целлюлаза и гликозидиаза. Показано, что грибы рода Pleurotus продуцируют ферменты в условиях, как твёрдофазной ферментации, так и глубинной культуры. Можно предположить, что интенсивность роста и экскреции белков зависят от генотипа продуцента, среды культивирования и других условий. Однако всё ещё не ясно, какие среды обеспечивают высокую продуктивность P. оstreatus, существует ли корреляция между интенсивностью экскреции гидролитических ферментов в среду культивирования и какие ферменты экскретируются в различных условиях[10].
Значительный интерес представляет изучение активности ферментов P. оstreatus по отношению к компонентам клеточной стенки дрожжей, в частности, возможности её удаления с помощью этих ферментов. Дрожжи находят достаточно широкое применение в качестве пищевых добавок, а наличие клеточной стенки снижает эффективность их использования. Микроорганизмы, являющиеся источником для получения разнообразных ферментов, существенно различаются между собой по способности синтезировать данные биологически активные соединения. Эти различия проявляются как в ассортименте синтезируемых ферментов тем или иным микробным видом, так и в их активности и исходных свойствах......